牛海绵状脑病：同一健康与食品安全的临界点
牛海绵状脑病：同一健康与食品安全的临界点
James Hope
摘要 牛海绵状脑病（Bovine spongiform encephalopathy, BSE）是一种牛的蛋白质错误折叠导致的疾病，属于传染性海绵状脑病（Transmissible spongiform encephalopathies, TSE）或是朊病毒病的一种。牛海绵状脑病还包括山羊和绵羊的痒病，鹿科动物的慢性消耗性疾病（Chronic wasting disease , CWD）和人类的克—雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease, CJD）。第一例BSE于1986年在英国发现，是一种进行性神经系统疾病，动物感染后主要表现行为反常、焦虑、共济失调、对触摸和噪音过分敏感以及体重减轻。对病牛进行解剖发现其脑干组织呈海绵状水肿，病变与羊痒病的相似，相关部门对其进行生化分析和传播机制研究，最终确认这是一种牛的新型朊病毒病。早期病例流行病学分析表明，两者的感染源可能与饲料有关，于是英国各地采取了一系列措施严格限制使用哺乳动物源性蛋白对反刍动物进行饲养，并禁止在饲料或是其他的食品生产中使用牛的（内脏）杂碎。本章将从以下几个方面进行概述：英国乃至整个欧洲BSE发病率的起伏变化、被界定为一种人畜共患病的变异型CJD的出现、BSE作为一种朊病毒病的含义、诊断和在世界范围内控制BSE所面临的挑战。
1朊病毒：BSE的致病因子
朊病毒（Prion）是由染色体DNA基因编码的蛋白质，在细胞内表达时凭借其多肽链的可变折叠功能在细胞内或是在细胞与生物体之间传递信息。正常细胞蛋白质转化为朊病毒形式通常涉及构象变化，这种构象变化可以影响蛋白质的自联程度以及与其他分子相互作用的能力(Wickner et al. 2009)。在酵母和真菌中，由特殊蛋白质组成的朊病毒是一种非染色体遗传形式存活特性的分子基础，但在哺乳动物中是第一次既作为慢性神经退行性疾病，又作为传染性海绵状脑病（TSE）的一种病原体来研究。TSE的特征是哺乳动物的朊蛋白（prion protein, PrP）以朊病毒的形式聚积在动物和人的中枢神经系统和外周组织中(Prusiner 1997)。痒病即绵羊和山羊的TSE，克—雅氏病（CJD）是人类最常见的TSE，而新的变异型克—雅氏病（vCJD）则被认为由牛的TSE传播引起的，即将疯牛病（BSE）传染给人。
2疯牛病简史
疯牛病（BSE）在过去25年中严重影响了英国的畜牧业，并限制了世界范围内牛制品和动物饲料的贸易。第一例BSE发生于1985年4月，但直到20个月以后的1986年12月，Weybridge中央兽医研究所才采用病原学方法确诊牛群中的这类疾病(Wells et al. 1987)。期间有超过10万头牛感染了这种潜伏期长并且不能用血清学、聚合酶链反应或是其他宰前检验方法所检测到的疾病。自此临床病例开始流行，并于1993年在不列颠群岛达到高峰，全年累计检出超过37,000例（www.defra.gov.uk/vla/science/sci_tse_stats；图1）。调查显示，奶牛似乎比肉牛的患病风险更高，但不管是何种性别的牛，发病牛龄大多数为4~4.5岁（1.8~18岁之间）。
图1 BSE流行曲线和英国饲料禁令效果
在英国，流行初期阶段BSE通常发生在3~5岁的牛群，但随着流行态势减弱和暴露水平下降，出现此疾病症状的牛群平均年龄已经逐渐超过了13岁(EFSA 2009)。每个国家发病高峰年的不同反映出BSE从英国蔓延至整个欧洲交错流行的特性。由于病牛在其病情进展过程中不会表现明显的临床症状(Wilesmith et al. 1988)，并且无法检测BSE的无症状携带者，这样限制了关于避免使用受感染动物的组织用于制作饲料以及药物产品措施的改进。
3饲料禁令和加强禁令后的出生病例
对受BSE影响牛群采用流行病学分析发现，一种蛋白饲料添加剂是最可能的感染源(Wilesmith et al. 1988)。重复利用受感染牛群的排泄物也许是这种疾病持续存在的原因。英国在1989—1990年间出台了关于反刍动物蛋白饲料的法规，旨在消除1988年以后出生牛群的感染，1996年该法开始变得更加严格，并在2001年在整个欧洲加强了这些禁令。最初英国禁令是为了防止反刍动物的同类相食，停止供应反刍动物的肉骨粉（meat and bone meal, MBM），从而防止朊病毒在牛群中的反复传播和扩散。这种措施起到一定的作用但却有着显著的地域性差别，英国的南部和西部较北部和东部更有成效（见图1）。由于北部和东部地区的猪所占比重高于牛群和羊群，因此人们开始怀疑是否应该在反刍动物的饲料成分中掺杂猪和家禽的饲料（在猪和家禽的饲料里面是可以添加反刍动物的肉骨粉的）。1994年11月，相关法令禁止向反刍动物喂食任何哺乳动物蛋白饲料（仅少数例外，如血液和牛奶中的蛋白质）。而1996年出现BSE和vCJD联系的相关报道以后，当局不再允许向任何养殖的家畜（包括鱼和马）喂食哺乳动物蛋白饲料。随后，整个欧洲对饲料实施了更加严格的控制以限制欧盟贸易区内BSE的传播，并于2001年彻底禁止对用于食品生产的动物喂食任何加工过的动物蛋白（PAP）。但并不是世界上每一个有BSE风险的国家都实施了类似的严格禁令，而目前欧盟期望缓解立法所面临的窘境，其中部分原因就是因为担心感染性货物入境，因而再次引入BSE。用猪和家禽的动物蛋白来饲养鱼也仍在谨慎考虑中，虽然这些途径对于BSE的再发影响可能很小(EFSA 2011)，但是成员国之间对于用家禽的动物蛋白来饲养猪以及用猪的动物蛋白来饲养家禽这些问题也仍存在争议。同类相食（即用某种加工动物蛋白来饲养同种动物）已被广泛抵制，欧洲似乎也并未打算用反刍家畜动物加工蛋白来喂食任何一种动物。
在BSE历史高峰时期的1993年，英国每周报道临床病例超过1000例，最后一例临床病例于2009年由被动监测系统发现（见图1）。英国（及欧盟的其他一些国家）于2001年对病死牲畜和屠宰场的健康动物挑选出来的不同队列（出生于1996年的喂饲禁令之后）开展了疾病主动监测。2011年检测了约50万只动物，其中仅有7只检出BSE（均为死亡牲畜）。截至2012年6月英国仅检出一例感染BSE的动物。虽然饲料禁令对流行曲线产生了显著影响，但2000年欧洲加强禁令之后在牛群中仍能检出BSE病例，食用被污染的蛋白饲料依然是造成大多数“禁令颁布后的出生病例（born after the real ban, BARB）”出现的疑似原因。尽管英国最近发生的两例BARB，包括2012年的这一例，均有L型不典型BSE的分子特性（见下文Stack等人的报道），但这些出生于禁令颁布之后的病例它们的生物与生化特征却与较前流行早期的病例相似。
与BSE流行的同时，传染性海绵状脑病的自然病例报道也首次见于牛的近缘种属——大弯角羚、羚羊、白斑羚、非洲大羚羊、阿拉伯大羚羊和弯角剑羚(Cunningham et al. 2004)以及猫科类动物，如美洲狮、猎豹或家猫中。除了一些大弯角羚的病例，其他动物由于缺少详细的喂养记录，我们很难证明动物发病与污染的饲料存在关联(Cunningham et al. 2004)。
4对BSE朊病毒最低有效剂量和特定危险物质的控制
利用感染BSE的病牛脑组织匀浆进行口服实验证实摄入1mg脑组织（大约10~100只小鼠的半数感染剂量）即可在8~10年的潜伏期后导致发病(Arnold et al. 2007, 2009; Wells et al. 2007)。英国(Wells et al. 2007)和德国(Hoffmann et al. 2007)学者曾在牛身上使用更大剂量的匀浆（至100g）来研究BSE的口服发病机制。他们用朊蛋白的免疫组化技术证实了这些研究，并对朊病毒在下消化道（远端回肠和空肠）早期的分布进行了生物测定。结果显示，朊病毒通过自主神经系统从腹腔肠系膜神经节上行至中枢神经系统，经过腹腔—肠系膜上神经节、内脏神经、腰部/尾椎胸椎脊髓或是经由迷走神经扩散。这些感染组织分布实验的结论已被用作修订不同年龄段牛群中禁止供给人类食用的具备特定风险的原料清单，并且为人和动物的暴露危险评估提供了依据，这些评估机制也明确了多年来英国和欧洲关于BSE控制管理的政策，例如最近欧洲食品安全局发表的关于食用牛肠的BSE风险的意见等。
5 BSE的非典型形式
在欧洲针对异常朊蛋白于牛群中开展的BSE定期监测，可将牛的TSE进一步分为两个不同的类别：分别称之为H型和L型（或简称为BASE）BSE(Casalone et al. 2004; Biacabe et al. 2007; Jacobs et al. 2007; Polak et al. 2008)。在欧洲以外的地区（日本和美国）也检测出类似病例(Hagiwara et al. 2007; Clawson et al. 2008)。尽管没有法定要求在病例报告时必须区分典型和非典型的BSE，但据文献报道显示，目前世界范围内大约有60例非典型BSE病例（约检测5千万健康动物以及死亡牲畜的结果）报告。
法国最近发表的一篇文章，回顾性研究了在2001~2007年期间通过欧盟强制性监测计划所发现的所有朊病毒阳性的牛(Biacabe et al. 2008)。结果显示，无论是“感染危险组”或是“健康状态屠宰组”，通过速测法检测到的H型和L型BSE动物病例均在8岁以上。该项研究所检测的8岁以上动物的H型和L型传染性海绵脑病的报告频率分别为1.9/100万和1.7/100万。而欧盟所有的非典型病例均出生于2001年1月，即禁令开始生效或扩展施行之前。因此，与经典BSE一样，这些动物不能排除因食用低滴度传染性BSE污染的饲料而发病。然而法国H型和L型病例的出生年份分布规律却与经典BSE明显不同，这可能是因为两种非典型BSE都是自发产生的散发病例。事实上，美国一例H型BSE病例与一种野生型的朊蛋白氨基酸序列上的一个可遗传的、牛的E211 K突变有关（密码子211中一个赖氨酸替换了一个谷氨酸），并且可以通过颅内接种传播给携带同种突变等位基因的牛犊，接种后存活时间为301天。然而其他非典型病例的朊蛋白基因开放阅读框的DNA测序却并未显示出这种或其他任何编码区域的突变情况。
H型和L型（或BASE）BSE经过脑内激发，能传播给可表达牛和绵羊朊蛋白的近交小鼠和Tg小鼠。L型的BSE也可传播给表达人类朊蛋白等位基因的转基因小鼠(Buschmann et al. 2006; Beringue et al. 2008; Kong et al. 2008)。近交小鼠和Tg VRQ小鼠的传播和连续传代说明了经过种间传代，BASE可以产生经典BSE(Beringueet al. 2007; Capobianco et al. 2007)。然而，我们需要注意没有在其他转基因小鼠身上发现L型BSE到经典BSE的基因表型聚合包括表达绵羊朊蛋白ARQ等位基因的小鼠(Buschmann et al. 2006; Beringue et al. 2007)。具有经典BSE特性的朊病毒同样出现在H型BSE的野生型小鼠的连续传代中(Baronet al. 2011)。尽管这些现象仍需一套独立的实验来验证，但是引发了经典BSE可能重新从非典型BSE病例中出现的讨论。在传代细胞培养中一个朊蛋白株突变为另一个朊蛋白株的概率为1/10万(Oelschlegel et al. 2012; Weissmann 2012)。但无论是实验还是动物的自然传递规律，一种朊蛋白突变为另一种朊蛋白（如从一个非人畜共患病的痒病变为人兽共患的BSE的显性）的概率还不能确定。
目前经典传染性BSE的快速筛查试验的灵敏度和特异度是已知的，但是H型和L型的灵敏度和特异度却未知。这些试验以脑干为靶组织，因为牛的中枢神经系统是最早检出病理性改变和朊蛋白的位置(Hope et al. 1988; Wells et al. 1998)。不同于经典BSE，我们对非典型BSE的发病机理了解甚少，而且脑干或许不能作为检测H型和L型BSE的最佳靶位(Casalone et al. 2004)，因此H型和L型BSE达1~2/100万的患病率可能仅是一个低估值。H型和L型BSE已经传播到牛群(Lombardi et al. 2008; Fukuda et al. 2009)，且不同于经典型BSE，每一型的分子与病理特征都被保留了下来(Balkema-Buschmann et al. 2011; Okada et al. 2011a, b; Konold et al. 2012)。目前已有一些关于感染了非典型BSE后牛的外周组织传染力分布的数据(Iwamaru et al. 2010; Okada et al. 2011a, b; Suardi et al. 2012)，虽然较小型反刍动物的朊蛋白分布受到限制，但是感染L型（BASE）牛的各种骨骼肌具有感染性（用Tgbov小鼠由生物方法测得）并且在肌肉纤维中发现了免疫蛋白沉淀。
6小型反刍动物BSE
Foster和同事的研究结果显示牛BSE可以通过饲养或是脑内接种传染给ARQ/ARQ绵羊和山羊(Foster et al. 1993)。随后也有几个研究报道BSE朊病毒在ARQ/ARQ绵羊中有着广泛的传播，发病机制与经典型痒病的自然病例相似(van Keulen et al. 2000)。虽然有人担心小型反刍动物BSE在混合感染是可能被认作“痒病”，但可通过其生物和生化特性将其在盲法试验中区分出来。历史上，由于对小型反刍动物喂食与BSE来源有关的同种蛋白质补充剂，欧盟担心它们可能会被绵羊和山羊感染而产生第二拨vCJD，从而加强了对绵羊和山羊的TSE的监测和对“没有BSE”和“不排除BSE”的实验室诊断。对小型反刍动物的BSE的确诊则需要应用一种生物方法，这种生物方法应用了与区别变异型克-雅氏病和BSE特征时所使用的同样的近交系小鼠(Bruce et al. 1997)。在严格的标准下只确诊了两例小型反刍动物的BSE（均为山羊）(Eloit et al. 2005; Jeffrey et al. 2006)，并且目前预测欧洲小型反刍动物的BSE发病率可能很低。
7变异型克-雅氏病
1996年4月，Will和同事报道了一种新型变异型CJD（Vcjd）(Will et al. 1996)，它的首发症状、临床表现、于英国聚集性发生的特点、分子结构(Collinge et al. 1996)和传播途径(Lasmezas et al. 1996; Bruce et al. 1997)均与BSE相似，立即引起了疯牛病是其源头的猜测（见图2）。牛肉与牛副产品为控制疾病的传播而被严格管制。尽管如此，仍有约3百万的病牛运往人类食物供应链(Ghani et al. 2000)。目前我们仍可以感受到它的影响及英国为了防止人与人之间二代传播所付出的代价(Garske和Ghani 2010)。
截止2012年6月，英国已经报告原发性病例176例，与输血有关的二代病例3例。另外，法国报告26例、西班牙5例、欧洲其他地区16例；美国、加拿大、沙特阿拉伯、中国台湾省和日本均有病例报告（www.cjd.ed.ac.uk/vcjdworld）。人类朊蛋白基因组多态性和基因突变可影响人类TSE的存活率和临床病理表型，vCJD已经明确了和密码子129（甲硫氨酸或是缬氨酸）二态性有关。在正常的白种人中这种二态性的比例为39%MM，50%MV和11%VV。在散发的vCJD病例中，这一比例为65%MM、17%MV和18%VV。所有确诊的vCJD临床病例都是MM纯合子，虽然一例M/V杂合子的受血者出现亚临床表现，但在其脾脏中检出的是克雅氏朊病毒(Peden et al. 2010)。
图2英国的BSE和vCJD：时间联系。左边粗条：BSE；右边细条：vCJD病例
英国人口中vCJD流行的实际程度只能通过一些临床的低发病率来估计，当地已经开展多次大规模调查，采用IHC或ELISA的方法寻找淋巴组织中（扁桃体或阑尾）存在异常朊蛋白（PrPCJD）的生化证据，这可为估计人群患病率提供依据。朊蛋白在动物间的传播和复制机制的研究表明淋巴网状组织在这些疾病的病理机制中起到主要作用，同时在vCJD患者的扁桃体和脾中也检出异常朊蛋白。在1995—1999年间医院存有档案的外科摘除扁桃体和阑尾的早期研究中，用免疫组化技术检测12,674份标本的PrPCJD时发现有三例的阑尾样本中含异常朊蛋白。所有PrPCJD阳性个体都在20~30岁的队列中，该年龄组的患病率约为380/100万（95%置信区间：80~1120/100万）(Hilton et al. 2004)。1961—1985年的出生队列是一个高危队列，包含了英国80%的vCJD病例。
每种分析方法的灵敏度和特异度均不同，95,672例（其中约有18,000例是来自1961—1985年的高危出生队列）来自英国匿名扁桃体档案的扁桃体标本，研究人员采用ELISA 法检测其PrPCJD，并没有检出阳性样本(Clewley et al. 2009)；随后的研究继而使用免疫组化技术，在1961—1985年出生队列的9672例扁桃体样本中却检出一例阳性样本(de Marco et al. 2010)。在最新的阑尾筛查研究中，32,441个合适样本中有12~18个存在着异常朊蛋白积累，并且这些免疫组化阳性标本出现于所有密码子-129基因型：MM、VV和MV。总患病率约为493/100万（95%置信区间：82~801/100万），与之前的结果一致。但令人惊讶的是只有13%的vCJD患者出生于1941—1960年之间，患病率最高为733/100万（95%置信区间：269~1596/100万），出现在年龄更大的出生队列中(HPA2012)。
8同一健康
欧洲对于饲料和特定危险原料的严格控制措施对于BSE的流行起到了有效的遏制（并且限制了人于朊蛋白的暴露），但朊病毒作为一种表观遗传且结构重排的蛋白质不太可能被消灭，如果回归到过去不加限制地对动物喂饲加工过的动物蛋白，将会引起传染性BSE在食用性动物中再现。BSE和vCJD的出现，及其对于我们食品安全的观念和实践所产生的影响都强调了寻求一种统一的、全球化的方法解决朊病毒困境的必要性，从而维持农业可持续发展和满足世界人口食物供应。由此可见，同一健康理念历久弥新。